细胞生物学的研究方向(6篇)

细胞生物学的研究方向篇1

1细胞共培养的方法

细胞共培养技术目前应用的方法可分为单层混合共培养技术、非接触式共培养技术和组织工程支架技术。单层共培养是将两种以上细胞放入同一器皿中共同培养的方法,非接触式共培养是通过Transwell小室来实现的。将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下室以聚碳酸酯膜相隔,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。组织工程支架技术是将在体外培养、扩增的正常组织细胞种植到具有良好生物相容性且在体内可逐步降解吸收的组织工程多孔支架上,使细胞在支架上增殖、分化[6]。现阶段美白药物筛选常用的是单层混合共培养技术,非接触式共培养还未见用于美白药物筛选,而组织工程支架技术中的皮肤类似物将可能成为发展方向。

2细胞共培养技术在美白药物筛选领域的应用及发展

黑素合成和转运的每一个过程都有着精细的调控机制,其中任何一个环节出现结构和功能的异常,都有可能引起皮肤色素异常性改变[7-9]。黑素生成是发生于黑素细胞的细胞器黑素小体,此过程包括黑素小体的形成和在L-酪氨酸酶作用下转化成为黑素的生化途径。酪氨酸酶是这一生物合成过程的关键酶,其活性与黑素合成量密切相关,控制其活力即可控制黑素生成量。因此,可通过抑制酪氨酸酶活性和黑素生成量来筛选美白药物,黑素细胞单独培养或黑素细胞与角质形成细胞共培养将是美白中药筛选的有效途径。

大量学者尝试通过黑素细胞单独培养来筛选能够使黑素合成、转运受阻的美白药物。杨壮群等[1,10-12]均通过单独培养黑素细胞筛选出有些中药提取物可以抑制酪氨酸酶活性、降低黑素含量,表明单独培养黑素细胞是一种筛选美白药物行之有效的方法。但随着对皮肤构造的深入了解,研究者意识到与黑素细胞相连的角质形成细胞对其发挥的作用不容忽视,罗增香等[13]通过中药单体蛇床子素、黄芩苷对黑素合成的研究发现,共培养体系中药物对黑素合成的抑制作用强于单独培养的黑素细胞,说明了两种培养方法确实存在差别。由于细胞共培养体系更接近正常人皮肤的真实构造,得出的数据更有说服力,所以研究者便把筛选药物的方法从黑素细胞单独培养向黑素细胞和角质形成细胞共培养过度,而更接近人体皮肤结构的皮肤类似物也有希望成为美白药物筛选的新方法。

2.1单层混合共培养的应用:单层混合共培养是将所研究的不同种类的细胞在同一培养器皿中混合培养。它提供了类似体内的复杂微环境,包括细胞与细胞间的接触反应和细胞因子的作用。由于其操作简便,目前广泛应用于模拟人表皮微环境的实验研究。1988年,Halaban[14]首次成功地将黑素细胞和角质形成细胞共培养,验证了该模型的可行性。马慧军等[15]也成功建立了人表皮原代黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型,为美白药物的筛选提供了可行的方法。仲少敏等[16]选取85种生药醇提物和水提物在melan-a与SP-1共培养体系做实验研究,熊果苷作为阳性对照,结果川芎、威灵仙、桂枝、麦冬、白果、蒿本、红花、白苏叶的醇提物,五倍子的水提物在细胞培养水平对黑素生成有明显抑制作用,强于相同浓度熊果苷的作用,这一结果可为美白药物筛选提供依据。兰海龙等[17]以人包皮组织作为细胞来源,体外构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型,检测芦荟苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后对黑素细胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响,发现三种单体均对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成产生浓度依赖性抑制,初步阐明了美白药物的作用机理。解士海[4]通过建立人表皮黑素细胞-角质形成细胞共培养的体外模型,研究了丹皮酚、苦参碱、氧化苦参碱、大黄素等中药单体对黑素合成过程的影响,结果表明通过观察黑素小体的转运证明了共培养模型的成功建立;熊果苷、丹皮酚、苦参碱剂量依赖性抑制共培养体系中黑素小体的转运;大黄素、氧化苦参碱对于黑素小体的转运无影响,表明丹皮酚具有很好的美白应用开发前景,大黄素及苦参碱有待进一步研究。左付国[9]建立了人的黑素细胞与角质形成细胞共培养模型,研究了熊果苷和淫羊藿苷两种中药单体对黑素小体转运的影响及其可能的作用机制,发现熊果苷可通过诱导黑素细胞树突退缩,抑制黑素小体的转运,这一研究结果为熊果苷作为美白药物提供了一项新的依据。

2.2皮肤类似物的应用前景:单层混合共培养模型可以对美白药物进行有效的筛选,但Tae-JinYoon等[18]通过实验证明了黑素瘤细胞或黑素细胞单独培养或是与角质形成细胞共培养得到的数据与三维皮肤类似物的均有不同,而皮肤类似物更能准确地表现组织学构造,所以皮肤类似物模型,有望用于中药美白药物的大范围筛选,提高工作效率。人类正常皮肤主要以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主,其中Ⅰ型胶原含量最多,由于胶原分子结构中含有大量的双羧基及双氨基氨基酸和碳水化合物,适于细胞的粘附;胶原又是一种广泛存在于动物皮肤、肌腱和其他结缔组织中的天然蛋白质,来源广泛。因此,在胶原重组膜上接种人黑素细胞和角质形成细胞可以建立皮肤类似物模型。Lee等[19]利用含角质形成细胞和黑素细胞的皮肤类似物模型检测化合物光毒性,结果显示光生物学效应与天然皮肤很接近;Damour等[20]很早便指出组织工程皮肤将成为评估化妆品原料及产品皮肤刺激、光毒性、光保护等特征的有用工具,这都为皮肤类似物模型成为筛选美白中药的有效途径提供了依据。杨颖等[21-22]分别从胎牛皮和大鼠鼠尾腱中提取胶原纤维,再经处理制成生物相容性良好的胶原作为支架,在支架材料上种植成纤维细胞构建皮肤类似物模型。杨壮群等[23-24]通过人永生化表皮细胞(HaCaT)和黑素细胞共培养体系接种在鼠尾胶原凝胶支架上构建皮肤类似物模型。张铁良等[25]将鼠尾胶原溶液、浓缩培养基、NaOH溶液和以血清重悬的成纤维细胞溶液在适当的比例下混合后形成凝胶构建真皮类似物。刘源等[26]也运用组织工程方法以包皮组织作为细胞来源构建含有黑素细胞的皮肤类似物模型。虽然以上皮肤类似物模型的建立多是用于研究皮肤缺损的修复,美白中药筛选还未有人使用这种模型,但由于皮肤类似物模型有可能与人皮肤组织融合,将使得中药美白药物筛选的数据更加可靠,筛选方法更加有效,可以作为美白药物筛选的新尝试。

3小结

现今,通过细胞共培养技术筛选美白药物已成为研究的热点。细胞共培养技术经历了单层细胞的接触、非接触式共培养到三维皮肤类似物,共培养方法已日趋成熟。单层细胞共培养由于操作简单适合于实验室中药物筛选的研究,而且该模型接近真实的人体生理环境,使研究者能够更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点,填补了一种细胞单独培养和整体动物实验的空白[27],用此方法已筛选出了许多有效的中药提取物,有些已用于美白产品中。而三维皮肤类似物模型由于已验证了它与人类缺损皮肤的融合能力,证明了它与正常人皮肤具有良好的相似度,用该模型进行药物筛选得到的结果将更具有可信度。如果能够商品化皮肤类似物,将为中药美白药物的筛选提供一个更方便、快捷、有效的途径[28]。共培养技术的不断发展给研究者带来了新的机遇与挑战,在研究者的共同努力下将会得到更加方便、有效的药物筛选方法。

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细胞生物学的研究方向篇2

[关键词]中药；骨髓间充质干细胞；增殖；凋亡；分化；研究进展

[收稿日期]2013-12-22

[基金项目]国家自然科学基金项目（30860357）

[通信作者]李玛琳，教授，E-mail：

[作者简介]方健康，硕士研究生，E-mail：

骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMCSs）已有半个世纪的研究历史[1]，并日益受到研究人员的广泛关注。BMSCs在一定条件下可向成骨细胞、软骨细胞、心肌样细胞、血管内皮细胞、神经元样细胞、肝细胞、脂肪细胞等多个方向分化。BMSCs所具备的这种多向分化潜能和自我更新能力，以及较容易获取、体外扩增快、低免疫排斥等优点，使其成为干细胞研究的热点。近年来，研究人员利用中药对体外培养的BMSCs进行干预，以探索这些中药对BMSCs增殖、凋亡及分化等生命活动的影响。这些探索将有助于阐明中医药的作用机制，将对我国中医药事业、重大疾病研究、细胞工程、组织工程等生命科学技术领域的发展产生积极的影响。

1中药促进BMSCs的增殖

细胞增殖是生物体最重要的生命活动之一，是生物生长、发育、繁殖、遗传的基础。近几年研究发现，多种中药对BMSCs的增殖具有一定的促进作用。曾意荣等[2]用由熟地黄、杜仲、补骨脂等组成的补肾活血复方颗粒对4周龄SD大鼠连续灌胃给药7d（高剂量组4.4g・kg-1，中剂量组2.2g・kg-1，低剂量组1.1g・kg-1），末次给药1h后进行腹主动脉采血，获得补肾活血中药含药血清。分别用这些含药血清培养P3代的大鼠BMSCs（药物组为10%的含药血清，对照组为10%的正常血清），观察其生长情况，发现含药血清组BMSCs的增速明显快于正常对照组，且与用药量基本成正比。张文信等[3]用金匮肾气丸复方含药血清对新西兰兔BMSCs进行体外干预，发现10%金匮肾气丸含药血清能够提高新西兰兔BMSCs的活性，促进GO/G1期的BMSCs向S期转化，最终促进BMSCs增殖。同样具有促BMSCs增殖作用的中药还有黄精[5]、菟丝子[6]、何首乌[7]、左归丸[8]、接骨散[9]、人参皂苷Rg1[10]、黄芪多糖[11]、羌活鱼[4]等。

机制：黄进等[6]认为，菟丝子之所以能促进BMSCs的增殖，可能与其促进了骨形态发生蛋白-2（BMP-2）mRNA的表达有关。另有研究[12]发现，龟板通过调控核转录因子E2F实现对BMSCs的促增殖作用。而何首乌[13]含药血清之所以具有促进大鼠BMSCs的增殖的作用，可能与其促进干细胞因子（SCF）mRNA的表达有关。

2中药抑制BMSCs的凋亡

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞程序性的死亡。研究表明，多种中药能够抑制BMSCs的凋亡。伏学坤等[14]将BMSCs在1%O2及无血清培养基条件下培养24h后，分别观察加或不加人参皂苷Rg1（ginsenosideRg1）时BMSCs的生长情况。结果发现加Rg1的高（500μg・L-1）、中（100μg・L-1）、低（10μg・L-1）剂量组BMSCs的凋亡率明显低于对照组，且剂量越高作用越明显。提示人参皂苷对低氧-无血清培养诱导的BMSCs的凋亡有一定的保护作用，即能抑制其凋亡。于勤等[15]研究发现，低（4mg・L-1）、中（40mg・L-1）剂量的薯蓣皂苷能够使缺血条件下P4代大鼠BMSCs的凋亡减少，表明其同样具有抗BMSCs凋亡的作用。其他如黄芪[16]、黄连素[17]等也能抑制BMSCs的凋亡。

机制：温肾补阳药含药血清[18]抑制BMSCs凋亡的作用机制主要是通过上调抑制凋亡基因Bcl-2的表达，下调促进凋亡基因Bax的表达，从而降低BMSCs的凋亡率。黄连素[17]则是通过抑制正活性氧（ROS）的释放和c-Jun氨基末端激酶（JNK）的激活，从而减少凋亡相关蛋白CytC的释放以及Caspase-3的激活，最终发挥抗BMSCs凋亡的作用。

3中药诱导BMSCs的分化

3.1中药诱导BMSCs分化为成骨细胞曾建春等[19]用含10%肉苁蓉含药血清的L-DMEM培养基分别培养P4代大鼠BMSCs10，12，20d，发现到第10天时ALKP染色阳性，第12天可见白色钙结节，第20天茜素红染色阳性。表明肉苁蓉含药血清有诱导BMSCs成骨分化的作用。史春民等[20]用10.0，1.0，0.1mmol・L-1的异补骨脂素分别处理在成骨诱导培养液中培养的PO代大鼠BMSCs，发现3个浓度的异补骨脂素均能够促进大鼠的BMSCs向成骨细胞方向分化，且浓度为1.0mmol・L-1的异补骨脂素的作用最佳。除此之外，具有此作用的中药或中药提取物还有土鳖虫[21]、接骨散[9]、杜仲叶提取物[22]、淫羊藿苷[23]、淫羊藿次苷II[24]等。

机制：张贤等[25]在研究杜仲醇提取物诱导BMSCs成骨分化过程中，发现SD大鼠BMSCs经诱导3d后，Wnt信号通路相关基因Fzd2，Fzd3，β-catenin，WIF1的表达量均有显著变化，提示Wnt信号途径可能参与了杜仲醇诱导BMSCs成骨分化的过程。川续断皂苷[26]诱导BMSCs成骨分化的机制可能与升高核心结合因子α-1（Cbfα1）的表达量有关，而中药骨康方[27]通过激活P38-MAPK信号通路以及促进Cbfal的表达诱导去势大鼠BMSCs的成骨分化。云南白药含药血清[28-29]促进BMSCs成骨分化的机制可能与影响BMP-Smad信号通路、P38-Mark信号通路等相关因子的表达有关。

3.2中药诱导BMSCs分化为软骨细胞研究者将0.5%的复方丹参注射液加到P3代大鼠BMSCs培养体系中，发现其不但能够明显促进BMSCs的增殖，还能促进其向软骨细胞分化[30]。Xiu等[31]用含10g・L-1鹿茸多肽的培养液培养P3代兔BMSCs，探讨鹿茸多肽对BMSCs软骨分化的影响，结果发现其对BMSCs向软骨细胞分化具有明显的促进作用。文献报道强肌健力饮[12]、复方透骨消痛颗粒[32]等也有诱导BMSCs软骨分化的作用。

机制：透骨消痛颗粒[32]能增加BMSCs中Ⅱ型胶原的表达，提示其促进BMSCs软骨分化的机制可能与促进Ⅱ型胶原表达量的升高有关。另有研究[12]发现，强肌健力饮中的一种化合物K9可能启动了BMSCs的软骨分化过程，且其机制可能与SHH信号通路有关。

3.3中药诱导BMSCs分化为心肌样细胞李志泉等[33]设计实验观察三七总皂苷（PNS）能否诱导BMSCs分化为心肌样细胞，发现150g・L-1的PNS能使P8代大鼠BMSCs的呈结蛋白（Desmin）、肌钙蛋白（cTnI）、α-心肌球蛋白重链（α-MHC）、β-心肌球蛋白重链（β-MHC）的表达呈阳性，表明PNS具有诱导BMSCs分化为心肌样细胞的作用。冼绍祥等[34]研究发现，终浓度为250g・L-1的黄芪甲苷可定向诱导P3代大鼠BMSCs分化为心肌样细胞。其他如复方丹参滴丸[35]、人参总皂苷[36]等也可诱导BMSCs分化为心肌样细胞。

机制：诱导BMSCs向心肌样细胞分化的作用多与抗氧化或促进某些诱导因子的产生有关，但具体机制有待进一步研究[37]。也有研究发现复方丹参滴丸[35]诱导BMSCs向心肌样细胞分化的同时，间隙连接蛋白CX-43表达上调，提示其作用机制可能与这一变化有关。

3.4中药诱导BMSCs分化为神经元样细胞Lu等[38]以丹参注射液作诱导剂干预P5代的大鼠BMSCs，探讨丹参能否诱导BMSCs向神经元样细胞分化，研究者将125μL丹参注射液与L-DMEM培养基混合，诱导BMSCs90min后，免疫组化检测到神经烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达均呈阳性，提示丹参有诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞分化的作用。研究发现，川芎嗪[39]、黄芪[40]、人参总皂苷[41]等也能诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞方向分化。

机制：陈亚男等[42]发现红景天苷能够激活胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）以及另外3个信号通路，即PI3K/AKT/mTOR，进而诱导BMSCs向神经元样细胞分化，提示其机制可能与这些通路有关。而裴晶晶等[43]认为红景天苷诱导BMSCs分化为神经细胞的过程与Ca2+密切相关。该实验组先用红景天苷诱导BMSCs12h，再分别加入含EGTA（细胞外Ca2+螯合剂）、Nifedipine（L型Ca2+通道阻断剂）、LY294002（IP3受体阻断剂）分别阻断细胞外Ca2+、L型Ca2+通道、IP3受体，结果发现在不加阻断剂的情况下红景天苷能够诱导BMSCs向神经元样细胞分化，而加阻断剂后神经元特异性烯醇化酶和Nurr1基因、蛋白的表达均显著下调，神经元样细胞分化受到抑制。提示红景天苷诱导BMSCs向神经元样细胞分化的机制与Ca2+有关。

4小结

综上所述，多种中药或中药提取物能够影响BMSCs的增殖、凋亡或分化，且有的不止有一种作用。如黄芪不仅能够促进BMSCs的增殖，还能抑制其凋亡[11，16]；人参皂苷不仅能够促进BMSCs的增殖，还能诱导其向神经元样细胞以及心肌样细胞分化[10，36，41]；鹿茸多肽不仅能够抑制BMSCs的凋亡，还能诱导其成软骨分化[14，31]。

从已有的报道来看，在中医上具有“补肾”、“壮阳”、“补气”、“补血”等补益作用的中药多能促进BMSCs的增殖、抑制其凋亡或诱导其分化。其中，具有“补肾”、“壮阳”作用的中药或其提取物多能够诱导BMSCs成骨分化，如肉苁蓉[19]、淫羊藿苷[23]、淫羊藿次苷Ⅱ[24]、杜仲[22]等，这与中医上强调的“肾主骨”的理论十分契合；具有“补气”、“补血”作用的中药或其提取物多能诱导BMSCs向心肌样细胞分化，如三七总皂苷[33]、黄芪甲苷[34]、复方丹参滴丸[35]、人参总皂苷[36]等，这与中医上强调的“心主血脉”、“气为血之帅”等理论也极为相符。揭示中医中药在BMSCs的研究中大有潜力可挖掘。

5问题与展望

尽管本领域的研究取得了上述令人鼓舞的进展，但也存在诸多问题。一是中药有效成分的问题。中药成分复杂，而产生相关药理作用的活性成分可能只有一种或几种，当前本领域的大部分研究缺乏对有效成分的深入探讨。二是机制研究的问题。多数研究只对作用进行了研究而未对相应的机制进行探讨，或仅开展了初浅的机制研究。三是BMSCs的体外培养、鉴定的问题。BMSCs的体外培养、鉴定等存在诸多问题，尤其是目前没有找到其特有的表面标记物[44]，使其鉴定还不能形成统一的标准。四是中药含药血清制备的问题。1988年日本学者田代真一首次提出“血清药理学”的概念[45]，6年后国内首次报道关于中药含药血清的研究[46]，含药血清的应用得到国内中药研究领域的广泛认可。本领域的研究也多采用了血清药理学的方法，但尚存在诸多问题。如：①“等浓”的问题。培养基稀释了含药血清的浓度，以至于细胞的体外培养无法有效模拟体内的反应。为了解决这个问题，研究者多会采用加大给药剂量的方法来实现“等浓”的效果。但此方法都有其自身的局限性，如血药浓度并不是随着给药剂量的提高而呈现线性变化[47]。②采血的问题。药物、采血方法、采血时间等多种变量可能导致血清有效活性物质的含量不尽相同。③灭活的问题。对于含药血清是否需要灭活存在诸多问题。如灭活可能会导致血清中一些稳定性差的活性成分失活，进而影响实验结果[48]。

众所周知，BMSCs是组织工程中比较理想的种子细胞，研究中药对BMSCs生命活动的影响，对我国的中医药事业将产生良好的推动作用，在细胞工程、组织工程、重大疾病研究等领域有广阔的应用前景。比如，利用某些中药具有促进BMSCs增殖的作用特点，可以将其应用到组织工程中对之进行安全有效的体外扩增，从而为科研、临床提供大量的种子细胞；利用某些中药可以诱导BMSCs成骨、成软骨分化的特点，可以为快速治疗骨折、骨缺损、骨质疏松等骨科疾病提供新的思路；利用中药诱导BMSCs分化为心肌样细胞的特点，可用干细胞移植的方法重建心肌细胞，这种方法安全、有效，可能是解决心肌梗死这一难题的有效途径[49]；利用中药诱导BMSCs成神经样细胞分化的功能特点，可能对神经系统疾病的治疗产生积极的意义。

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ResearchprogressoneffectsoftraditionalChinesemedicinesonproliferation，

apoptosisanddifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcells

FANGJian-kang，ZHOUYi-ping，LIMa-lin

（1.SchoolofTraditionalChineseMedicine，YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China；

2.SchoolofPharmaceuticalScience&KeyLaboratoryofPharmacologyforNaturalProducts，

KunmingMedicalUniversity，Kunming650500，China）

[Abstract]Bonemarrowmesenchymalstemcells（BMSCs）areakindofpluripotentstemcellsderivedfrombonemarrows，whichcannotonlysupporthematopoiesis，butalsohavecapabilitiesofmultidifferentiation，high-proliferationandself-renewing.Theyhavebecomeoneofhotspotsinstemcellstudies.StudiesoninvitrointerventionwithBMSCswithTCMshavemaderemarkableprogressinrecentyears.Accordingtothefindings，sometraditionalChinesemedicinescanpromoteproliferationofBMSCs，somecaninhibittheapoptosisofBMSCs，whileotherscaninduceBMSCstodifferentiateintomultiplecelltypes，suchasosteoblast.Furthermore，somestudiesalsoinvolvedrelevantactionmechanisms.Theauthorssummarizedtheadvanceinrelevantstudiesbyreferencetorelevantliteraturesofthisfield.

细胞生物学的研究方向篇3

【关键词】，下腰痛

下腰痛(lowbackpain)给患者和社会带来了沉重的负担，据统计，70％~90％的人一生中会经受腰背痛的折磨，其中10%~20％会发展为慢性下腰痛。脊柱融合术至今仍是对经保守治疗无效的下腰痛患者所采取的一种标准治疗方法。近年来因椎间盘退变性疾病、腰椎不稳等原因接受脊柱融合手术的患者逐年增加，随着此类手术的广泛开展，其存在的问题也逐渐引起了人们的重视。其中最主要的是假关节发生率高、临床疗效不佳〔1〕。为了解决这些问题，人们从脊柱融合的生物学和生物力学等多方面进行了尝试，包括内固定器械的广泛应用及融合技术的改进等，Bono等对过去20年发表的文献综合分析，结果表明所有上述技术改进对融合率和临床疗效均无显著影响〔2〕。这些研究结果促使人们寻找新的研究方向，提高融合率。随后研究的重点逐渐集中在通过生物学方法改进骨移植材料方面。

基因工程和组织工程的发展为解决这一难题带来了希望。大多数研究者认为选择合适的骨生长因子基因、病毒载体、合适的组织工程种子细胞以及支架材料十分重要，相关的研究也多是围绕这些方面展开，并且取得了很多研究成果。

1骨生长因子及病毒载体

能够促进骨愈合及脊柱融合的生长因子很多，目前人们研究的主要有以下几种：转化生长因子β(TGFβ)、成纤维细胞生长因子(FGH)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)以及骨形态形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)等，由于上述生长因子均在骨愈合的不同阶段分泌，人们普遍认为这些因子具有潜在的促进骨愈合的能力，逐渐引起了研究者的重视〔3〕。TGFβ超家族成员BMPs已被证实能在骨愈合过程中诱导未分化的间质细胞增殖、分化，诱导骨再生，促进骨愈合；并且在细胞生长及骨形成过程中扮演关键的角色，因而一直处于研究的重点。在已发现的20余种BMPs中，BMP2、BMP4、BMP7(OP1)的骨诱导能力最强。它们形成软骨和新生骨，在促进成骨及脊柱融合的实验和临床研究中已取得了成功的经验。然而，由于BMP的释放速度与新骨生长速度不匹配，单纯应用BMP的效果尚未理想，因此，应有合适的载体来调节BMP的释放速度。应用基因工程技术将BMP基因重组入宿主细胞基因组中，使BMP获得持续的表达是这一领域中重要的突破方向，研究者正致力于寻找合适的基因工程方法使其在临床骨科疾病的治疗中发挥作用，这一领域的研究进展极大地促进了脊柱融合的研究。

目前有以下几种研究方向：一个研究方向是用原核表达系统进行表达。由于原核细胞内无蛋白质剪切加工系统和糖基化系统，因此BMPs表达产物以包涵体形式存在于细胞浆内，而不能分泌出胞。依据原核细胞的非分泌性表达来获得高产量、高活性的BMPs至今仍有技术难度。第二个研究方向是在真核细胞中进行BMPs的表达。由于真核细胞表达系统培养条件要求严格，分泌型蛋白表达水平低，因此生产成本高，不利于进行大规模生产，限制了从实验研究走向临床应用的发展。第三个研究方向是采用病毒重组技术获得BMPs的持续表达。

病毒重组技术是目前研究的重点和热点。逆转录病毒介导的基因转移技术在欧美已用于某些遗传性疾病和骨外疾病的基因治疗〔4〕。但它只整合入增殖期的靶细胞，插入突变的可能性较大，限制了其进一步应用。腺病毒载体具有较大的宿主范围，目前在基因治疗的研究中较多〔5〕。但重组腺病毒仅存在于细胞浆中而不能整合入靶细胞染色体，外源基因只能瞬时表达；而且它存在免疫原性以及野生型病毒污染的可能，安全性值得注意。这促使人们寻找其它更适合BMPs表达的病毒载体。在这种情况下，腺相关病毒(adenoassociatedvirosis，AAV)和慢病毒逐渐引起了人们的重视。人们研究发现AAV几乎可以感染所有已建立的体外细胞系，且野生型AAV对人类无致病性。AAV基因组可以整合入宿主细胞的基因组DNA中，保证了外源基因长期稳定表达；AAV末端重复序列中的转录元件方向不指向宿主DNA，插入突变的可能性很小；该病毒载体可整合入分裂及非分裂期细胞，宿主范围较宽〔6〕。Chen等对AAV在骨组织工程中的应用进行了很多有益的尝试，他首先发现AAVBMP2可以高效转染C2C12细胞，促进成骨，具有极好的应用前景〔7〕，随后他联合应用AAV及腺病毒表达BMP2基因，发现两者均可明显的促进成骨，且具有较好的协同作用，Ad可以促进AAV介导的BMP2的表达〔8〕。在此基础上，Chen等进行了更深入的研究，采用不同的目的基因――BMP4，构建AAVBMP4转染小鼠C2C12细胞，观察到明显的促进成骨作用〔9〕。

2种子细胞

种子细胞是组织工程学中的最重要、最基本的环节。作为骨组织工程学理想的种子细胞，应该具有以下特点：结构简单；取材容易，对机体损伤小；体外培养时增殖力强；自我更新，一定的条件下能向特定的方向分化；稳定表达成骨细胞表型；植入体内后能继续产生成骨活动；无致瘤性。建立一个能够持续、稳定表达目的基因的细胞系是组织工程骨治疗的关键。

人们对于自体骨组织及骨膜来源的骨髓细胞、成骨细胞研究的最早，其取材和培养方法也较为成熟，但取材困难、来源有限、易老化，限制了进一步应用。干细胞具有多向分化性，控制培养体系可向成骨细胞分化，是目前研究的热点。干细胞分为组织干细胞和胚胎干细胞；胚胎干细胞虽然具有很多优势。但面临很多伦理性及安全性问题，如致瘤性问题尚未解决；相对而言，组织干细胞可能是近期应用的最佳种子细胞来源〔10〕。其中研究最多的是骨髓间充质干细胞(BMSCs)和肌源性干细胞(MDSCs)。

BMSC是广泛存在于骨髓间质内的未分化间质干细胞，具有取材方便、易培养和多分化潜能等优点，曾被认为是一种理想的组织工程种子细胞。Riew等用腺病毒载体携带BMP2基因转染新西兰兔BMSC，与明胶海绵复合，植入兔L5~6横突间。术后2周，组织学检查即可见新骨形成；术后7周，横突间有明显的成熟骨小梁，而对照组则无新生骨形成〔11〕。

但是随着相关研究的深入，人们发现了BMSC存在的问题――基因转染效率较低，不利于BMP基因长期高效表达。人们开始致力于寻找一种更优的靶细胞，高效表达BMP类基因。肌源性细胞(MDCs)引起了研究者的关注，He等研究发现腺病毒介导的BMP2、4、6、7、9等基因可以高效转染成肌细胞系C2C12细胞，明显表达碱性磷酸酶(ALP)的活性，BMP5、8、10、11、12、13亦可引起C2C12细胞ALP的活性升高；而在多能性间充质祖细胞中，仅有BMP2、7、9可以诱导出明显的ALP活性，BMP4、7的作用较弱，其它则无此类作用〔2〕。Chen的研究也支持这一结论〔8~9〕。Rose等进一步比较了MDC和BMSC在转染BMP4基因诱导成骨中的作用。研究者分别应用逆转录病毒转染小鼠MDC和BMSC，用以表达BMP4，2组细胞分别植入鼠股骨骨缺损模型处，观察成骨情况，术后8周和12周2组均可观察到骨桥形成，但MDCBMP4组密度显著高于BMSCBMP4组，前者无骨不连发生(本组14只)，而后者发生骨不连者为6只(本组17只)；研究者认为MDC在骨缺损的治疗中要明显优于BMSC〔13〕。Wright等研究发现，包含BMP4基因的逆转录病毒可以高效转染MDSC，分泌高水平的功能性BMP4因子，在免疫活性小鼠的实验中，异体移植的MDSCs也可以诱导健康的新生骨形成，作者认为基于MDSCs的基因治疗技术在促进骨愈合上极具潜力〔14〕。Shen等比较了MDCs不同的亚群在诱导成骨中的作用，他们发现PP6中的MDSCs作用最强，为骨组织工程的发展寻找一种更加理想的靶细胞提供了可能〔15〕。MDSCs在骨组织工程中的作用，逐渐得到了人们的认同，对其研究得到了越来越多的重视〔16~20〕。

3生物支架材料

骨组织工程中理想的生物支架材料应满足以下特点：具有良好的生物相溶性和生物降解性，具有骨传导性和骨诱导性，具有一定的生物力学强度和刚度。目前应用的生物支架材料种类很多，主要包括天然高分子材料和人工合成高分子材料两大类，各具优缺点。前者中常用的有脱钙骨基质(DBM)、胶原等，具有生物相溶性和生物降解性优良、利于细胞黏附生长、骨诱导性好等特点，是应用最广泛的生物支架，但是其生物强度较低，具有一定的免疫原性，限制了其进一步应用。后者常用的有PGA、PLA、PLGA、羟基磷灰石、磷酸三钙陶瓷等，这类材料普遍存在生物降解与组织形成速度不匹配，骨诱导性不佳等缺点，并非理想的生物载体。人们为了寻找一种理想的生物支架材料，进行了大量的研究。Martin等进行的一项研究，分别采用不同剂量的rhBMP2与不同载体复合，植入29只恒河猴L4~5横突间融合模型中。研究者发现在标准的BMP2作用剂量下，由于胶原海绵载体被压缩，从而阻碍了骨诱导，作者推测可能是由于组织间的挤压作用，BMP2被挤出了海绵载体；如果在胶原复合rhBMP2时，填充的时间足够长、对组织压缩采取了相应的机械保护，即使较低剂量的rhBMP2亦可以有效地促进骨诱导〔21〕。Usas等则通过比较4种不同的支架载体研究发现，一种新型的支架材料Gelfoam和胶原作为成骨性细胞的载体效率最高，且两者骨矿化成形作用模式相似，而Gelfoam克服了胶原存在的部分缺陷，是一种较为理想的支架材料，研究者结合异位成骨的相关研究结果认为Gelfoam是骨诱导支架的“金标准”〔22〕。

4基因治疗在脊柱融合中的作用

近年来，大量的研究证实了基因治疗促进脊柱融合的可行性。目前，多数学者采用BMP家族基因中的BMP2、BMP7进行促进脊柱融合的实验研究。Wang等用AdBMP2转染骨髓基质细胞，植入兔L4、5横突间，在所有应用BMP2组，术后4周均良好融合，组织学观察均可发现骨小梁形成，在未采用BMP2的所有对照组，仅有少量新生骨或者无新生骨形成；作者认为基因治疗的方法可以有效促进脊柱融合〔23〕。Jenis等研究表明BMP7(OP1)在脊柱融合早期可以促进成骨〔24〕。Sandhu等也认为BMP2、BMP7可以有效促进脊柱融合。新近的研究证实rhBMP4促进脊柱融合的作用强于rhBMP2，所需剂量仅为rhBMP2的十分之一，且成骨量与剂量成正相关，为BMP4在脊柱融合方面的应用提供了理论和实验基础。Guo等通过大鼠的脊柱融合动物模型证明，BMP4能促进非骨髓源性间充质干细胞分化成为成骨性细胞，进而促进局部成骨，提高脊柱后外侧融合的融合率〔25〕。李广恒等应用包含BMP4基因的腺病毒载体，转染兔BMSCs，高效表达BMP4因子，并植入兔横突间，有效促进了脊柱融合〔26〕。

5结论与展望

如何有效地促进脊柱融合，提高融合率和临床疗效，减少并发症，一直是脊柱外科医生难以解决的难题。基因治疗和组织工程的发展为解决这一难题带来了希望。人们对此进行了大量的研究，取得了一系列研究成果。通过基因治疗和组织工程方法构建的骨移植替代材料在动物实验中已经取得了良好的疗效，可以在脊柱融合部位长期高效稳定表达骨生长因子，有效地促进脊柱融合；Boden等在灵长类动物实验的基础上，已经成功地将NeOsteo及rhBMP2等因子应用于人体的临床实验，报告了极佳的临床疗效〔27〕。这些研究成果必将极大的促进相关研究的继续深入，为组织工程骨早日进入临床奠定了理论和实验研究的基础。

但是作者也注意到了目前存在大量尚待解决的问题。基因治疗的研究仍然停留在较低等动物的水平上，缺乏高等动物的相关研究，对于灵长类动物的研究目前还未见到基因水平上的报道；由于物种进化的复杂性和多样性，在低等动物身上证实有效的骨移植物并非一定能成功应用于较高级的动物，人们还需要应用灵长类实验动物来检验其功效。基因治疗的安全性还未得到有效验证，人们对其尚存很多争议；在其作用的有效剂量、效费比等相关问题上仍存在着较大分歧。目前在病毒载体、种子细胞、生物支架材料等各个方面，研究者尚未取得共识：病毒载体的安全性问题有待于进一步解决；如何寻找一种能够高效转染并且长期稳定表达目的基因的靶细胞也是研究者关注的热点问题；而研究中应用的生物支架载体均存在某些缺陷，目前尚无一种具有良好的生物相溶性和生物降解性、具有骨传导性和骨诱导性以及良好的生物力学强度和刚度的载体材料。上述这些问题限制了基因治疗和骨组织工程在脊柱融合中的进一步应用，人们必须进行长期艰苦的探索才能有效的解决这些问题。

尽管基因治疗还存在着很多问题，但其研究的兴起仍为脊柱融合的研究提供了一种全新的思路。人们有理由相信，随着相关研究的逐渐深入，人们一定会解决这些问题，为基因治疗在促进脊柱融合中的应用奠定良好的基础。

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细胞生物学的研究方向篇4

项正兵吴晓牧

中图分类号：R392.4文献标识码：A文章编号：1672-1349(2007)07-0604-02

随着人类胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)的使用，提出了许多伦理学上和病人特异性胚胎干细胞获得的困难性上的问题，选择成体干细胞作为细胞移植替代治疗变得非常现实。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell，BMSC)作为一种自体干细胞，具有很强的自我更新、增殖能力以及多向分化的潜能。BMSC在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱、肌肉细胞、神经细胞等多种细胞。由于BMSC有取材方便、易于体外培养扩增、植入体内不易引起免疫排异反应、不存在伦理学争议等众多优点，且最近的研究表明BMSC在体内、外都能被诱导成神经元样细胞，且植入体内能改善神经功能缺损症状。因此，BMSC的研究越来越受到人们的关注。本文结合最新进展就体外诱导BMSC向神经元样细胞分化的方法及其可能的机制进行综述。

1以抗氧化剂为基础的诱导方案

BMSC向神经元样细胞的分化，首先由Woodbury等报道，他们用抗氧化剂β-巯基乙醇(β-mercaptoethanoi，BME)或二甲基亚砜(dimethytsulfoxide，DMSO)／丁羟茴香醚(butylatedhydroxyanisole，BHA)等体外诱导成年大鼠和人BMSC分化。发现BMSC呈现为神经元形态，同时表达神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE)、神经元核抗原(neuronalnuclearantigen，NeuN)和神经微丝M(neumfilament－M，NFM)等神经细胞标志物。5h后，被诱导的细胞表达神经干细胞标志物神经巢蛋白(Nestin)；6d后，Nestin表达消失，而TrkA(一种神经生长因子受体)则在5h至6d持续表达。这提示BMSC经诱导后先分化为神经干细胞而后逐渐向成熟的神经细胞转化。此后，这一诱导方法被广泛用于BMSC向神经元体外分化的研究。抗氧化剂诱导作用机制尚不清楚，研究证实，活性氧在细胞增殖分化过程中起到第二信使的作用，抗氧化剂是否通过改变BMSC内的氧化还原状态使其分化为神经细胞有待进一步研究。近年来在探讨抗氧化剂诱导BMSC体外分化机制时，有的研究发现，用DMSO和BHA等化学诱导剂使BMSC在1h内诱导分化为神经元样细胞，其实是由于细胞骨架结构肌动蛋白断裂、细胞收缩而产生的一种现象。Lu等也证明，在BME或DMSO／BHA诱导BMSC分化过程中，在不同时间点对镜下相同视野观察，形成的所谓神经元样细胞的突起是细胞延长部分收缩而成。化学诱导剂诱导神经元样细胞形成可能是化学物质产生的毒性使细胞收缩或细胞骨架变化的结果，并不能代表复杂的细胞分化进程。

2以提高胞内cAMP为基础的诱导方案

Deng等联合应用异丁甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine，IBMX)和双丁酰环腺苷酸(dibutyrylcvclicAMP，dbcAMP)提高BMSC胞内cAMP的含量，6d后，发现约25％的BMSC在形态上转变为神经样细胞。最近Long等用NEUROBASAL培养液诱导BMSC向神经细胞分化，即在dbcAMP和IBMX以提高胞内cAMP基础上加入新的细胞因子如脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)、人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor，hEGF)和碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，hFGF)。诱导6d，66％的细胞具有典型的神经细胞树突形态，免疫组化和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)证实部分细胞表达早期的神经标记物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有细胞表达成熟神经细胞的标记物，如神经丝蛋白(neurofilament，NF)，NeuN，Tau，胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。关于提高胞内camP浓度能促使BMSC向神经细胞的分化的机制，有人认为可能与cAMP能激活PICA或p38，ERK1/2等信号途径有关。最近Jori等认为除了胞内cAMP浓度的增加会激活经典的PKA途径从而影响BMSC向神经细胞的分化外，MEK-ERK信号等也和BMSC向神经细胞诱导分化有关。此外，cAMP还可引起POU家族转录因子Brn-3a表达的增加。Brn-3a在神经元的早期分化中起关键作用，它调控了NF，α-intexnextin等多种神经轴突骨架蛋白的表达。

3以细胞生长因子为基础的诱导方案

细胞的增殖和分化受各种生长因子的影响，在这些因素中，神经营养因子的作用尤为关键。Smmhez-iarrlos等建立了主要以神经营养因子V为基础的诱导BMSC分化为神经细胞的培养体系，诱导7d～14d后，发现有BMSC分化为神经细胞。近年研究显示，EGF，bFGF，BDNF和胶质细胞源性神经营养因子(glial-derivedneumtrophicfactor，GDNF)等因子在BMSC向神经细胞分化中起着重要的作用，已有科学家利用DNA测序方法检出这些细胞因子的受体存在于BMSC的细胞膜上，因而有人推测这些因子与其相应受体结合后，可将有关信号转导致细胞质或细胞核内，从而发挥对细胞的调控作用，但确切机制尚不清楚。bFGF是体内重要的神经营养因子，可促使神经干细胞增殖并决定其分化方向，并具有加快胶原降解，恢复凋亡细胞活力等重要功能。它可能参与BMSC向神经元分化的启动，是一种有效的有丝分裂原和分化抑制因子，可影响中胚层、神经外胚层的细胞增殖和分化。Kim等发现，FGF和维甲酸(retmoicacid，RA)诱导人BMSC后，16％的细胞表达NF。BDNF在神经细胞发育、存活及损伤修复中起关键作用，对BMSC在体外向神经细胞分化具有明显的促进作用。

4以维甲酸(RA)为基础的诱导方案

RA是一种重要的形态发生素，在胚胎期对胚胎干细胞(ESC)向神经细胞分化起重要作用。有研究表明RA能诱导ESC向神经细胞分化，随着浓度的不同而变化，低浓度RA诱导ESG分化为神经前体细胞，高浓度RA促进神经前体细胞分化为成熟的神经元和胶质细胞。离体的研究表明RA在神经系统各部位的发育也起重要的作用。RA促进神经系统背腹侧、首尾端的形成。此作用也因RA浓度不同而变化。低浓度RA诱导拟胚体细胞主要向腹侧表型分化，而高浓度RA诱导拟胚体细胞背侧化。RT-PCR显示低浓度RA处理组的拟胚体细胞中后脑特异性标志物(otxl，otx2，en1，hoxb1，hoxa2)阳性，而脊髓神经标志物阴性。浓度RA处理组后脑和头端脊髓标志物(hoxc4，hoxc5，hoxc6)表达增加，前脑和中脑标志物表达降低。高浓度RA诱导ESC分化为后脑和脊髓躯体运动神经元；而低浓度RA诱导ESC分化为后脑内脏运动神经元或支配上肢的躯体运动神经元。低浓度RA可诱导腹侧化，在此过程中音猬因于(sonichedgehog，ShE)表达水平升高有关。Wichterie等用RA和Shh或Shh激动剂Hh-ag1.3联合处理拟胚体可诱导ESC分化为运动神经元，该作用随HhAg13浓度增加而增加，而RA联用Hh抗体，则检测不到运动神经元的分化。可见RA和Shh均是在神经发育过程中的重要因子，在MN的形成中有不可或缺的作用。目前已有使用RA与抗氧化剂或细胞因子联合成功诱导BMSC向神经元细胞分化的报道。但是有关使用RA和Shh成功分化为MN的研究对象都是ESC，尚未见BMSC向MN分化的报道，因此，成功诱导BMSC分化为功能性神经元将具有重要意义。2005年，Kondo等D0]的研究表明BMSC内能表达RA受体(RAR)及Shh信号传导途径的一些分子。BMSC预先经FGF2和福斯高林(一种血小板凝集抑制剂)处理后，再经RA和Shh联合诱导后的BMSC能表达谷氨酸能感觉神经元的标志物，BMSC的可塑性进一步被证实。认为其机制可能是RA与细胞核内的RAR结合进而调控一系列基因表达，使细胞表型和分化发生改变。另外将BMSC置于胚胎10d的脑／体节／听泡条件培养液时，发现BMSC中感觉神经元的标志物上调和促进突起生长。提示在适当的体内模拟环境下BMSC可向特点的神经元分化。有可能将来代替ESC，以避免使用ESC引起伦理学争议。

5BMSC在体外与神经细胞共培养方案

BMSC除了在上述诱导剂、细胞因子等的刺激作用下能向神经细胞分化外，BMSC与神经细胞混合培养时也能使BMSC分化为神经元细胞，且分化率升高。如将BMSC与新生胎鼠脑组胞共同培养时，其向神经元分化的能力远大于BMSC单独培养的结果，NSE和NF的表达显著增高，这说明细胞与细胞之间的相互接触也是BMSC分化的一个重要原因。有研究将星形胶质细胞与BMSC共培养时，发现星形胶质细胞能够明显促进BMSC向神经元方向分化，这是因为星形胶质细胞不仅对神经元有支持营养作用，它还能释放一系列神经营养因子、生长因子等，从而主动参与神经元信息处理过程，调控神经干细胞的分化，刺激神经元的产生。说明脑内局部微环境在BMSC移植入体内分化成神经元的过程起着重要的作用。

细胞生物学的研究方向篇5

近年来人们对干细胞的认识逐渐增加，当知道干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童，让青春永驻时，人们便开始企盼着干细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。

【关键词】干细胞生物特性应用

近年来人们对干细胞的认识逐渐增加，当知道干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童，让青春永驻时，人们便开始企盼着于细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。

1干细胞的概念

干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。按照干细胞的分化潜能，分化层次及其所具有的功能，大致可分为三种类型：胚胎干细胞、组织干细胞和专能干细胞。胚胎干细胞又称全能干细胞，是从哺乳动物包括人的早期胚胎分离培养出来的。其分化潜能大、增殖能力强，既是胚胎发育的基础，又是机体各种细胞最早的祖先，由它可形成完整的生物个体，如早期的卵裂球细胞、胚泡中的内细胞群中的细胞、早期生殖嵴的胚芽细胞等。从某种意义上说受精卵也可视为特殊的全能干细胞。胚胎干细胞在进一步的分化中，可形成各种组织干细胞，又称多能干细胞，它具有分化出多种细胞组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如多能造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等均属于此类。这些多能干细胞在一定条件下可分化成定向发育的、多系列的专能干细胞。专能干细胞只能分化成某一类型的细胞．专能干细胞的分裂是不对称性的，即在其所形成的2个子代细胞中，1个仍保留原来干细胞的全部特征，以维持机体内干细胞在数量上和质量上的稳定；而另一子细胞却开始分化，发育，最终形成新的具有特定形态和功能的体细胞，以对正常相应组织细胞加以补充，维持细胞器官生长与衰亡之间的动态平衡。由于全能干细胞分化发育成体细胞的过程，是一个连续的过程，也是细胞数量上由少到多，功能上由幼稚到成熟的增殖、放大的过程。

2干细胞的生物学特性

干细胞具有多种生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。干细胞本身不是处于分化途径的终端，它可连续分裂几代，也可在较长时间保持静止状态；干细胞通过两种方式生长，一种是分裂形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂，一个子细胞最终分化为功能细胞，另一个分裂成为干细胞保留下来；干细胞表现出很强的可塑性，其调控机制目前尚未清楚。

2.1胚胎干细胞(ESC)的生物学特性ESC细胞具有早期胚胎细胞相似的结构特征，有较高的核质比和正常的整倍体核型。胚胎细胞在发育的不同阶段，其细胞表面出现不同的抗原。未分化的人ESC细胞表面SSEA3、SSEA4、TI160、TRA181等呈阳性。而未分化的小鼠ES细胞表面仅SSEA1抗原阳性Ⅱ［1］未分化的ESC细胞表达高水平的端粒酶活性和转录因子Oct4，碱性磷酸酶染色呈阳性。胚胎干细胞的表面抗原是指在胚胎干细胞未分化状态下高度表达，一旦分化，基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达，可成为鉴定胚胎干细胞的依据［2］。

2.2成体干细胞的生物学特性成体干细胞(ASC)是一类具有自我更新，高度增殖和多分化潜能的细胞群，有横向分化能力。目前国内外学者研究热点是其横向分化能力。其机制还不清楚，目前被大家接受的观点主要有以下几种：（1）异质干细胞的存在；（2）原始多能干细胞的持续存在。美国的学者JiangY等［3］提出成体骨髓中确实存在一类被称为多潜能的成体干细胞(MAPC)，MAPC表达Oct4、Rex1，虽然较ES细胞表达低，但一般的成体干细胞不表达；（3）细胞融合，移植的1细胞与不同谱系的宿主细胞自发融合，导致遗传信息的转移，形成的杂合细胞遗传了两个亲代细胞的特征，如TeradaN等［4］研究证实骨髓基质细胞通过细胞融合表现出其他细胞的表型。ASC的鉴定识别主要通过三种途径［5］：分离培养和形态学观察；免疫表型鉴定；分化功能检测。分离培养和形态学观察是最直接简单的鉴别方法：如利用问充质干细胞(MSC)在培养瓶中可贴壁生长的特点，弃去未贴壁细胞，得到MSC集落，用显微镜观察细胞形态来辨别细胞。免疫表型鉴定是目前研究最多的，虽然其特异性比较高，但所需的实验条件较高，表面抗原试剂价格昂贵，且由于大多数成体细胞没有独特的免疫标记物，只能通过排除其他细胞来确定是否为目的细胞来识别鉴定：只有造血干细胞具有特异性的表面抗原CD34，而MSC就没有特异性表面抗原，它不表达CD34、CD14、CD45，只表达SH2、SH3、CD29、CD106、CD166。分化功能检测法主要是通过观察ASC诱导分化是否能生成预期的细胞类型来反证是否该种类型的干细胞：如MSC可诱导生成成骨细胞及软骨细胞，只要通过染色等方法证实诱导生成的细胞是成骨细胞或软骨细胞即可证明是MSC细胞，此法在目前的研究中用到比较多。

3干细胞的应用

3.1移植治疗移植治疗目前已经成为治疗疾病的一个重要手段，如器官移植、细胞移植等。干细胞移植是一个尤其重要而意义重大的手段。从20世纪80年代起，造血干细胞移植已经成为治疗癌症、造血系统疾病、自身免疫系统疾病的重要手段。之后，外周血干细胞移植并辅以化疗及细胞因子CG-CSF、GM-CSF等，可使更多的干细胞进入外周血。1989首例脐血治疗Fanconi贫血成功后，许多国家纷纷建立了规模不等的脐血血库。因脐血富含造血干／祖细胞、其免疫细胞的抗原性较弱、C，IL祖细胞较少、移植相关GVHD的发生相对骨髓的外周血少而轻，采集容易、对供者无任何伤害。故被认为是极具潜力的新造血干细胞的来源［6，7］。神经干细胞的研究为神经系统疾病的治疗提供了广阔的应用前景。啮齿类中枢神经细胞系包括中枢神经干细胞已被用于许多鼠的疾病模型，如鼠遗传性神经退化症，包括脱髓鞘症、脑神经节苷脂沉积症和其它神经退化紊乱(包括多巴胺能神经．如肾上腺髓质．胚胎腹侧中脑和畸胎瘤组织的移植)治疗研究中［8］。神经干细胞的临床价值已在治疗帕金森病中得到证明。

3.2克隆动物及转基因动物的生产自绵羊“多莉”问世至今，体细胞克隆动物多有成功的报道。但体细胞克隆动物有着无法克服的弊端，即成功率低和容易早衰，“多莉”羊在它存活的第5个年头也终难逃一劫。而Wakayama等用长期传代(30代以上)的小鼠Es细胞克隆出31只小鼠，14只存活，可见存活率大大提高。因此KS细胞克隆动物具有光明前景。转基因动物是利用受精卵或ES细胞作为载体，通过注射目的基因，从而生产带有目的基因的动物。转基因ES细胞系将为大量同系转基因动物的生产奠定基础。应用干细胞进行动物克隆，可以有效地提高稀有动物的繁殖和高效畜产品的生产，以及高效生物活性物质的生产［9，10］。

3.3转基因干细胞基因治疗现有的基因治疗有2类：（1）转基因细胞治疗。（2）核酸治疗。前者常用的基因转移靶细胞多为淋巴细胞、成纤维细胞等。其缺陷为细胞存活时间有限，在治疗过程中需要反复输注，治疗繁琐。转基因干细胞技术解决了转基因细胞存活问题，成为转基因细胞治疗重要的方向。近年来，人类基因组测序为认识生命现象以及疾病发生的物质基础提供和建立了完整的信息库，DNA芯片技术就是在此信息库基础上对疾病诊断的方法学革命。与此同时，“分子治疗”技术也倍受关注。但是，由于蛋白质分子量巨大难以进入细胞，只能作用于细胞表面分子而发生作用，而且基因治疗有依赖病毒序列作为基因载体的弊病，因此限制了“分子治疗”的应用。(11)如何克服这些弊病，改进技术，是分子治疗领域的主要课题之一。干细胞生物工程正是改造“分子治疗”的。(1)干细胞具有自我扩增和分化功能，因此导入的“外源基因”可以有效地得以扩散；(2)干细胞可以在体外进行操作，对基因的改造和修饰可以在体外完成并经筛选后再导人体内，避免由于基因插入而导致的细胞失常；(3)干细胞是人体细胞，作为载体其毒性最小，而且作为生命的最小单元，是导入组织的最佳形式。

3.4ES细胞为发育生物学研究的理想体外模型KS细胞具有全能性和无限增殖能力，并能在体外培养。因此，可以作为微环境改变对细胞分化影响的理想研究材料。随着现代生物技术的发展，研究不同生长调节因子在ES细胞分化中的作用，已成为可能。尤其是基因芯片技术的完善，通过mRNA差异显示，为ES细胞分化和不同分化阶段细胞的基因转录和表达的研究奠定基础，成为揭示发育和分化的分子机制的重要手段。

4存在的问题

干细胞研究虽然有很大的进展，但仍需解决许多难题：（1）干细胞的分离、纯化、增殖、鉴定的问题。这是所有问题的起点，如果没有扎实可靠的分离培养技术，也就没法进行后续实验研究。没有有效的增殖技术，就达不到细胞移植等治疗所需要的细胞数量。干细胞的纯化及鉴定目前虽然研究很多，但由于许多干细胞没有独特的表面抗原，所以其鉴定问题将是一大难题，需要各国科学家们进一步研究。（2）干细胞诱导分化的问题：每种组织细胞产生的诱导条件不同，这就需要研究者们后续摸索前进。（3）移植后免疫排斥反应：干细胞治疗虽然有广阔的应用前景，但利用ES细胞移植或异体干细胞移植治疗疾病过程中免疫相容性问题必须解决。一种解决ES细胞移植排斥反应，方法是从病人自身细胞的核移植分离hES细胞，这个概念称为“治疗性克隆”(12)；还可以通过暂时服用免疫抑制剂，然后逐渐停止服药；也可使用微胶囊法来阻止移植物与受体免疫系统间的相互作用等方法。（4）干细胞治疗中生物安全问题：干细胞在移植到体内后是否会分化成其他意料外的组织或引发其他疾病，这些都需要进一步的实验证实。其他的如伦理学和社会问题等等，需要学术界与政府机构共同协作，为干细胞的研究更上一层楼而努力。

5展望

基因组、后基因组计划和干细胞研究是20世纪与21世纪交替之际中生命科学中的两股强大的潮流，基因研究正在全力构筑起生命科学的基石，干细胞的基础研究及开发应用则将打开疾病治疗的突破口，它将成为21世纪生物产业的核心内容之一。美国《科学》杂志1999年和《时代》周刊和2000年相继将干细胞生物工程学评为世界十大科技成果之首，这项研究具有重要意义和诱人的应用前景，各国科学家都在关注和进行这一领域的研究，并吸引各种资本投入巨资投入这一领域，几乎所有的发达国家均成立了干细胞公司，开展干细胞生物学研究及提供干细胞应用服务。国内天津、北京、上海、广州等高校及科研单位也相继成立干细胞研究中心及干细胞技术公司。据最新报道，中国医学科学院天津血液研究所于2001年I1月4日通过了亚洲脐带血干细胞库的验收，该库从2001年4月18日接受第一例储存脐带血干至今，已收到近3000例脐血。南京市第一医院也将于近期用造血干细胞移植治疗严重的冠心病，使疤痕累累的心脏生长出新的心肌细胞。从目前发展的趋势看，干细胞的研究在不久的将来(3～5年)将会取得惊人的突破。如利用于细胞(特别是胚胎干细胞)培养产生人体各种组织器官，产生克隆器官，供人体移植使用，修补及替换损伤的组织器官，治疗各种疾病。但是在干细胞的研究中也存在着诸多困难有待于解决，目前急需解决的是各类干细胞分离纯化、鉴定、繁殖，它们之间定向分化的关系，临床实验应用中存在的问题等。应建立一系列可靠的技术方法，完善于细胞的建系。而且国际和国内应制定相应的法律法规，保证干细胞研究的合法化、规范化。

参考文献

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细胞生物学的研究方向篇6

1.1在蛋白质分析中的应用QDs最初用于生物领域是应用于简单的生物大分子,链接方法是将QDs通过带有氨基或羧基的试剂修饰,调节溶液环境,通过QDs表面的功能基团和生物分子上的氨基或羧基实现共价偶联或静电作用等来完成QDs与生物大分子(蛋白质、核酸、生物酶等)的链接,目前这一领域的应用仍然非常活跃。Nie[9]等人将QDs用于非同位素标记的生物分子的超灵敏检测,使巯基乙酸处理过的ZnS包裹的CdSeQDs通过酰胺键与转铁蛋白结合,进而能被细胞膜上的受体离子通道识别,进入细胞内部,在结合或传输过程中没有明显的干扰作用。这表明利用这种方法可以研究活细胞中供体/受体之间的反应或分子交换。Goldman等[10]曾将QDs与抗体结合,成功地对葡萄球菌肠毒素和2,4,6-三硝基甲苯进行了荧光免疫分析。Ghazani等[11]将组织微阵列技术、光谱分析技术与QDs相结合,发展了一种用于定量测定肿瘤中蛋白质表达的新方法。Mahtab等[12]将具有特定结构的核酸序列吸附于QDsCdS上,QDs表面敏化发光行为则能区分“直线型”、“弯曲型”和“扭结型”的双链寡核苷酸,在探测核酸结构的方法上有了创新。Koji等[13]构建了一种更新颖、快捷的蛋白质记录材料可根据光连接器提供的信息调整记录、阅读荧光蛋白的排列,清晰地读出蛋白质配体复合物的组成,该技术对生物芯片的微型排列具有重要的意义。

1.2在DNA分子研究中的应用QDs经过恰当的修饰可以与DNA分子进行连接。Ebenstein等[5]采用单QDs识别DNA结合蛋白。先将DNA与DNA结合蛋白交联,然后用偶联逆转录因子抗体的4种不同颜色的QDs标记上述交联复合物,经过一系列处理最后在单一光源的激发下,QDs于605nm、625nm、655nm及705nm发出绿、红、黄、白4种不同的颜色,通过荧光显微技术来分析判断蛋白质的位置从而能够确定DNA分子上的多个蛋白质的位置。Han等[14]利用不同颜色的QDs标记多色编码微珠与遗传物质条带连接,用于DNA杂交检测,在DNA的测序方面取得了突破性进展。Qi等[15]采用amphipol修饰QDs,amphipol具有交错的亲水性和疏水性侧链,可携带siRNA进入细胞质并保护siRNA防止其被酶解,实现了实时监测QDs-siRNA在细胞中的进出、内吞小体的逃逸、运输、传递过程,而这种多功能QDs的出现,也促进了实用基因组学和基因治疗学的研究。

1.3在活细胞及活体组织成像中的应用QDs荧光探针在多光子显微镜技术中的应用,使其在活组织中的多色成像成为可能。最早Dubertret等[16]将QDs胶囊注入非洲蟾蜍胚胎中观察其胚胎发育过程,发现胶囊QDs在生物体内很稳定,且毒性很低,不影响细胞生长和发育,也不易发生光漂白,是对QDs荧光探针用于活体组织的成功探索。Gao等[17]将QDs包于PEG-PLA中,连接麦胚芽凝集素(WGA-QDs-NP)后注入鼻腔,QDs经嗅觉黏膜组织进入大脑皮层细胞标记了大脑组织中的病变部位,促进了对中枢神经系统疾病的诊断和治疗方面的研究。Yum等[6]用纳米针将荧光QDs通过机械化学的方法渗透细胞膜进入活细胞的细胞质和细胞核,这较传统方法有了重大突破。Zhang等[18]利用CdHgTeQDs在近红外区针对裸鼠进行了荧光成像。结果显示近红外QDs荧光标记物具有更强穿透力、更易激发且检测灵敏度更高等优点,故可进行更长时间的生物体外和活体的实时跟踪和荧光检测,这标志着QDs作为新兴荧光标记物在活细胞生命动态过程示踪研究中将发挥极为重要的作用。

1.4在激素及生物因子研究中的应用QDs不仅可以在细胞水平及动物活体中应用,在细胞亚结构中甚至在激素和生物因子水平也有报道。Matsu-no[19]利用QDs的特性和激光共聚焦扫描显微镜对生长激素和泌乳刺激素及它们的mRNA进行了三维成像。Lidke等[20]将QDs标记到表皮生长因子上,通过激光共聚焦显微镜,观测到肿瘤细胞通过胞吞途径特异性摄取这种表皮生长因子的全过程。这些成果将为生长发育学和内分泌学的研究打开了一个新窗口。

1.5在肿瘤等疾病研究中的应用近年来QDs在细胞生物研究应用领域得到进一步拓宽,将QDs荧光探针用于肿瘤等疾病的研究具有突破性意义。早期Bawendi等[21]就提出利用近红外荧光QDs进行动物体内前哨淋巴结活组织检查的方法。他们将近红外QDs用多配位基配体包覆后注入动物体内进行整体成像发现,通过QDs标记,医生可看清lcm深组织下的前哨淋巴结,且可准确地指导手术进行,确保前哨淋巴结的完全切除。与传统的外科手术相比,前哨淋巴结的活组织检查可减少手术创伤,且检查结果更为准确。Yu等[22]用能靶向于肝细胞癌的甲胎蛋白抗体键合QDs作为荧光探针,通过整体的荧光成像系统对肝癌细胞进行成像来检测活体内的肝癌细胞。Tada等[23]采用背部皮肤固定器和高灵敏CCD高速共聚焦显微镜观察乳腺癌细胞特异性探针在老鼠体内的运动情况,这种高灵敏可视化示踪为癌症研究提供了新方法。Jiang等[24]将连接聚乙烯亚胺和透明质酸的QDs(PEI-HAQDs)注入B16F1细胞,结果显示在HA受体介导下,PEI-HA表现出对小干扰RNA(siRNA)特异的标识性能,而且PEI-HA-siRNA主要积聚在肝脏、肾脏和肿瘤。Bhirde等[25]通过将带有抗癌药—顺铂的QDs和表皮生长因子(EGF)分别偶联在单壁碳纳米管两端而把抗癌药带入癌细胞,并通过QDs观察抗癌药对癌细胞的作用,为癌症的治疗开辟了新天地。

2QDs作为荧光探针目前面临的挑战

QDs荧光探针技术最大的挑战就是如何克服其细胞毒性。最近Mahto等[26]对表面修饰的毒性进行了研究,发现不同修饰的QDs在细胞中的定位不同。共聚焦图像显示巯基乙胺MPA包裹的QDs主要分布在胞质区,而GA/TOPO(对表面配位基进行修饰)包裹的QDs在细胞中却没有发现。入胞的MPA包裹的QDs有良好的细胞相容性,而胞外的GA/TOPO包裹的QDs细胞毒性却很大。Li等[27]研究结果证实粒径大小对其毒性的影响,低于40μg/ml时,纳米级的CdSQDs毒性显着大于微米级的CdS。QDs的毒性机制仍需进一步研究,随着技术的发展,QDs的合成修饰有望走向“绿色化、低毒化”,为QDs更广泛的应用奠定基础。