单细胞生物的共同特点范例(3篇)

单细胞生物的共同特点范文篇1

P927-928

多器官功能障碍综合征（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS）是不同病因导致的以多个脏器功能障碍和内环境紊乱为特点的临床综合征，病程包括早期器官功能障碍的发生到衰竭全过程，炎症反应、凝血激活、免疫应答失调共存于MODS发病过程，其中免疫应答失调是最重要的致病因素。机体这种免疫应答失调的过程，严重时在临床上表现为全身炎症反应综合征（systemicinflammationresponsesyndrome，SIRS），进而发展为MODS。20世纪90年代已达成了"MODS是过度的SIRS或过度代偿性全身抗炎反应综合征（compensatoryantinflammatoryresponsesyndrome，CARS）引起的多器官功能障碍"的共识。而脓毒症是机体针对微生物感染的SIRS，1991年美国胸外医师协会和危重病学会在芝加哥联合召开的讨论会上即已明确指出，脓毒症是导致MODS的主要原因。而基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）及其抑制因子-1（tissueinhibitorofmetalloproteinases-1，TIMP-1）在脓毒症致MODS病程中起了重要作用。

1脓毒症诱发MODS的分子机制

MODS的发病机制十分复杂，学者们从缺血-再灌注、胃肠道屏障受损、炎症失控、代偿性抗炎失控、二次打击以及细胞凋亡等角度对其进行诠释。实际上，脓毒症本身也是一个复杂的病理生理过程，根据国内外相关的研究进展将脓毒症诱发MODS的机制总结如下：①机体在遭受严重感染打击时，立即启动防御机制，包括激活中性粒细胞、单核-巨噬细胞等炎症细胞，释放以肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）为代表的炎症细胞因子、蛋白酶等活性物质，并且与免疫细胞之间相互促进，这种免疫应激反应不断放大，发展为全身性的炎症反应。②机体启动全身炎症反应的同时，也启动了抗炎反应，以白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）为代表的抗炎因子大量释放，同时反应型CD4+T淋巴细胞亚群向非反应型CD8+亚群"漂移"，TNF-α、IL-2等炎症细胞因子分泌减少，单核细胞失活，发生全身抗炎反应，导致机体的免疫抑制。③虽然机体发生全身抗炎反应，但IL-1、氧自由基等炎症细胞因子和促炎物质可以使中性粒细胞延缓凋亡，从而延长炎症反应的持续时间。因此，脓毒症时机体实际上是处于持续的炎症反应和免疫功能低下状态，SIRS和CARS共存，它们并不是彼消我长的关系，而是脓毒症的两个方面，共同促进MODS发生。④脓毒症时，TNF-α、IL-1的大量释放以及内皮的激活和损伤可激活凝血系统，造成脓毒症机体的高凝状态。随着病程的发展，各种凝血因子、抗凝物质以及血小板被消耗，严重时发生消耗性凝血病，推进了MODS进程。⑤脓毒症时，TNF-α、IL-1、NO、前列腺素等生物活性物质可以使血管扩张，血管平滑肌对儿茶酚胺的反应性降低，造成血管的舒缩调节功能障碍，血流分布异常，另外血管通透性增加、动静脉短路开放均可造成组织灌注不足，发生功能障碍。⑥此外，脓毒症时，胃肠道、胸腺、脾脏细胞极易发生凋亡，造成肠道黏膜屏障和免疫功能受损，导致机体内毒素易位和免疫力低下，最终引发MODS。

2基质金属蛋白酶-9和组织抑制因子-1

MMP-9与其他MMPs成员一样，是锌离子依赖的蛋白水解酶，主要以明胶和Ⅳ型胶原（collagenIV，IV-C）为底物，因此又叫明胶酶、IV-C酶。而IV-C是各种基膜特有的重要成分。MMP-9在正常组织中表达量很少，但在炎症反应时，活化的中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞等可合成并释放大量MMP-9，破坏内皮、上皮基膜结构［4］,从而影响相应组织细胞功能。MMP-9的活性调节在基因转录、酶原活化、抑制物对酶的抑制三个环节进行，组织抑制因子-1是其内源性抑制物，常由分泌MMPs的同一细胞合成，可优先与MMP-9酶原或活化的MMP-9结合形成高亲和力的非共价键复合体，抑制MMP-9活性。TIMP-1还参与调节细胞的增殖，主要功能是促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，是近年研究热点。

3MMP-9和TIMP-1与MODS

单细胞生物的共同特点范文

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物

健康成年新西兰大白兔30只(由北京大学医学部实验中心提供)，雌雄不限，体质量1．0～1．5kg。

1．1．2主要试剂和仪器

ABCG2单克隆抗体(美国MILLIPORE公司)，细胞角蛋白(cytokeratin，CK)3单克隆抗体(美国MILLIPORE公司)，ANTI-BCRP1FITC(美国MILLIPORE公司)，黏蛋白5AC(MUC5AC)单克隆抗体(美国Abcam公司)，MTT(美国SCICRESTBIOTECH公司)。倒置相差显微镜(OLIMPUS，日本)，CO2培养箱(MCO-18AIC，SANYO公司，日本)，流式细胞仪(BD公司，美国)，酶标仪(SLT．SPETRAN公司，德国)，共聚焦显微镜(Zeiss公司，美国)，荧光显微镜(OLIMPUS公司，日本)。

1．2实验方法

1．2．1LSC的原代培养

采用组织块培养法。将兔子以过量乌拉坦静脉注射处死后，用碘伏棉球消毒眼睑周围3次，迅速取出眼球，在显微镜下去除眼球周围肌肉组织，生理盐水冲洗3次。在无菌条件下将处理后的眼球用含硫酸妥布霉素的生理盐水(硫酸妥布霉素注射液生理盐水=120配制)浸泡2次，每次15min;剪下角膜片，去除结膜、虹膜等组织，在体视显微镜下剪去角膜中央部分。无菌条件下将兔角膜缘组织剪成约1mm×2mm的组织块，将3～5枚组织块蘸取少量培养基后上皮细胞面向下置于培养皿中，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，2h后待其贴附良好时加入适量含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，继续置于恒温CO2培养箱中培养。每2d更换1次培养基，每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。

1．2．2LSC的传代培养

当细胞生长达到培养板的80%～90%时，PBS冲洗2次后，加入适量胰蛋白酶与细胞充分接触2～3min，待细胞变圆、细胞连接松弛时，加入含体积分数10%胎牛血清的培养基终止消化，吸管吹打使细胞脱离培养皿底，收集细胞悬液，1000r•min－1离心8min，按照12的比例接种于细胞培养皿及涂有多聚赖氨酸的细胞爬片上待测，每2d更换1次培养基，待细胞融合后，以同样方式继续传代。

1．2．3细胞形态学观察

倒置相差显微镜下观察各代LSC的爬出过程及生长状态，并将不同代数LSC固定(体积比为甲醇丙酮=11)，进行HE染色，显微镜下观察并拍照。

1．2．4LSC功能蛋白的表达

细胞免疫荧光检测:用固定液(体积比为甲醇丙酮=11)固定细胞爬片10min，将固定后的LSC爬片用PBS洗3次，然后用进口山羊血清封闭液封闭爬片30min，分别加入CK3(1100)、ABCG2(1100)、p63(150)、MUC5AC(1100)单克隆抗体，并以PBS代替一抗设阴性对照，4℃过夜孵育后分别加入IgG荧光二抗，室温孵育1h，DAPI复染细胞核，封片后激光共焦显微镜观察并照相，鉴定培养细胞CK3、p63、ABCG2及MUC5AC(1100)单克隆抗体的表达并拍照。

1．2．5流式细胞仪检测

将原代和传代后的LSC培养至形成单层，PBS洗2次，胰蛋白酶消化，1000r•min－1离心8min后，制成细胞悬液，用牛血清孵育30min，1000r•min－1离心8min后，细胞计数，然后每106细胞加入ABCG2-FITC单克隆抗体10μL进行标记，孵育30min，每10min摇匀1次，PBS洗2次，过细胞筛，流式细胞检测仪检测LSCAB-CG2-FITC单克隆抗体在培养细胞中所占的比例，比较原代和传代后LSCABCG2-FITC单克隆抗体的含量变化。

1．2．6MTT比色法测细胞活性

将50mgMTT溶于10mLPBS中，用0．22μm滤膜过滤后配制新鲜MTT液。细胞达到对数生长期时，消化、离心细胞，按照每孔2000个细胞的密度接种于96孔板，分别设12h、24h、48h、72h共4个时间点，每个时间点设5个复孔。每个时间点分别加入5g•L－1MTT溶液20μL，CO2培养箱中继续孵育4h后小心吸弃孔内培养液，每孔加入150μLDMSO，脱色摇床振荡10min，酶标仪测定各孔吸光度(A)值，参考波长为490nm。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制各代细胞的生长曲线图，比较原代和传代细胞的增殖活性。

2结果

2．1培养细胞形态学观察

角膜缘组织块在置于培养皿上2～3h后贴附良好。倒置相差显微镜下可见，24h后有细胞从组织块边缘个体迁移，贴壁生长，呈多边形，体积较小，48h后细胞局部可见拉网样生长趋势，72h后出现大片细胞，细胞呈现多边形或多角形，96h细胞几乎铺满整个培养板(图1)。显微镜下可见3种细胞形态:(1)圆形、卵圆形，类似基底的柱状细胞，核浆比大;(2)多边形，类似翼状细胞;(3)大而扁平状，类似表层上皮细胞。细胞以卵圆形或多边形为主，多为2～3个核仁，部分可见丝状骨架结构。显微镜下可见，原代细胞生长状态良好，细胞以多边形及卵圆形为主，可见双核细胞、多核细胞及核分裂相，细胞间连接紧密;传代后第1代细胞呈规则多边形，可见双核细胞，细胞间连接紧密，类似上皮样细胞，可见少量纤维细胞;第2代细胞形态呈不规则状，几乎无双核细胞，无细胞间连接，完全失去上皮细胞的特性(图2)。

2．2培养细胞免疫荧光染色和检测结果

2．2．1细胞免疫荧光染色

经鉴定，培养的细胞CK3、ABCG2、p63单克隆抗体染色均呈阳性，MUC5AC单克隆抗体染色呈阴性，证明为LSC细胞(图3)。原代LSCCK3单克隆抗体间接免疫荧光染色多数细胞不着色，少数细胞着色，细胞质呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光;第1代LSCCK3染色阳性细胞较原代细胞增多，第2代LSCCK3染色阳性细胞进一步增多。原代LSCp63单克隆抗体表达有很高的阳性率，圆形及卵圆形细胞的细胞核均呈红色荧光;第1代LSCp63的表达与原代细胞无明显差异，第2代LSCp63的表达明显下降(图3-4)。

2．2．2流式细胞仪检测

流式细胞仪检测结果显示，原代、第1代和第2代LSCABCG2单克隆抗体阳性率分别为13．41%、22．96%和4．43%。2．3细胞增殖活性检测传代后细胞与原代细胞比较生长曲线有明显的下降，而且原代细胞有明显的细胞增长期，但第1代细胞生长曲线对数增长期不明显，第2代细胞几乎无增长期。各代细胞增殖活性差别显著(图5)。

3讨论

3．1LSC的培养

目前，LSC的培养方法主要有酶消化培养法和组织块培养法［11］，其中，组织块培养法应用最为广泛。Short等［12］通过比较酶消化培养法和组织块培养法表明，组织块培养法培养的细胞能更好地保持细胞原有形态，具有更多的桥粒连接和更紧密的细胞连接，能更好的保持角膜上皮细胞的功能。有文献报道，组织块培养法培养的LSC并不是单一的细胞，而是混合细胞，细胞包含一定量的LSC、短暂扩充细胞、分化的角膜上皮细胞及少量纤维细胞。在本实验中，利用组织块培养法体外培养兔角膜缘上皮组织，培养4d左右可达到80%～90%的融合状态，说明培养的角膜缘上皮细胞具有较强的分裂增殖能力;另外，形态学上细胞具有体积小，圆形或卵圆形，可见双核细胞、多核细胞及核分裂相，细胞间连接紧密等原始细胞生物学特性，说明组织块培养法培养的LSC具备作为LSC移植的种子细胞的特点。

3．2LSC的鉴定

现阶段国内外对LSC的基础研究仍然很薄弱，尤其是在LSC的标记物方面，迄今为止尚未找到一种LSC特异性表达分子标记物［1，6，13-14］，因此，只能选择几种目前比较确切的标记物组合如ABCG2、p63、CK3来鉴定LSC;在LSC中ABCG2、p63表达呈阳性，而CK3表达为阴性。AB-CG2蛋白在细胞膜和细胞浆内表达，阳性表达细胞分布于角膜缘上皮基底层的小细胞簇，其增生能力显著高于阴性细胞，最符合角膜上皮干细胞的特征。p63为一种白，表达于全角膜的基底层和基底细胞上层，其阳性表达是角膜缘强增殖能力细胞的标志［1，6，13-16］。CK3是一组非水溶性细胞骨架蛋白，在角膜上皮细胞特异地表达，被认为是角膜上皮分化细胞的标记物;然而CK3角膜基底层细胞不表达，呈现未分化的自然状态，为LSC鉴定的阴性标志物。MUC5AC是结膜细胞特异性表达标记物。本研究免疫荧光染色结果显示，培养的细胞CK3、ABCG2、p63抗体均呈阳性表达，而MUC5AC单克隆抗体为阴性表达，说明培养的细胞为角膜分化上皮细胞、LSC和短暂扩充细胞的混合细胞，且无结膜细胞的污染。本研究结果显示，p63在大部分原代细胞中表达阳性，第1代细胞p63表达与原代细胞比较无明显差异，而第2代细胞p63表达明显下降;CK3仅在少量原代细胞中表达，随着传代次数增加CK3表达阳性率逐渐增加。综合分析后表明，原代和第1代细胞能较好地保持LSC特性，可作为临床角膜缘上皮细胞移植的种子细胞。

3．3LSC含量的测定

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关键词：力达霉素烯二炔类抗生素；抗肿瘤

力达霉素(lidamycin，LDM)是从我国湖北省潜江县土壤分离出的一株放线菌StreptomycesglobisporusC1027代谢产物中筛选出的1个新的大分子蛋白类抗肿瘤抗生素。力达霉素的化学结构中含有烯二炔结构的发色团，是烯二炔类抗生素中重要的成员之一。近两年来，由于烯二炔类的抗生素化合物分子构成新颖并有极强的抗肿瘤活性，已成为化学、药理学、分子生物学的研究热点。目前针对力达霉素的多方面的研究工作已取得的长足进展。现就力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、分子作用机制与抗肿瘤活性、单克隆抗体高效偶联物、组合生物合成等方面的研究工作成果作一综述。

1、力达霉素的分子结构与生物合成

力达霉素为新型烯二炔类抗肿瘤抗生素，它由1个辅基蛋白和1个发色团构成。蛋白部分由110个氨基酸组成，含有2个分子内二硫键，计算相对分子质量为10500u，蛋白质部分没有抗肿瘤活性，但对发色团有稳定和保护作用，并携带发色团到达肿瘤部位。发色团在抗肿瘤活性中发挥主要作用［1～3］，发色团由1个9元环1，5二炔3烯核心结构与氮氧杂萘甲酸、氨基吡啶核糖和β酪氨酸结合而成(Fig.1中1)。这些结构单元不但参与化合物分子的组成，而且与化合物的生物活性密切相关。借助核磁共振对辅基蛋白及其与发色团的复合物进行结构分析并确定各个结构单位的相对位置，发现芳构化的发色团结合在辅基蛋白结构中的“疏水口袋”处，它们之间的亲和性可能来自辅基蛋白“疏水口袋”区氨基酸侧链与发色团之间形成的静电和疏水作用［4］。发色团核心的烯二炔结构的生物合成途径一直是人们关注的焦点。烯二炔结构中首尾相接的乙酸结构单元曾被推测是由不饱和脂肪酸的前体被切割和环化后形成或是通过聚酮合成途径，由烯二炔聚酮合成酶催化聚线性不饱和聚酮中间产物的生物合成，接着采用一种新颖的环化机制而形成烯二炔核心结构。刘文等［5］运用PCR方法成功地克隆了力达霉素脱氧氨基糖代谢途径中的dNTP葡萄糖4，6脱水酶基因(sgcA)，并以此为探针，通过基因文库筛选和染色体步移克隆了完整的生物合成基因簇，发现力达霉素的生物合成起源于聚酮代谢途径，并确定了基因簇编码1个烯二炔聚酮合成酶SgcE，排除了由脂肪酸合成然后降解的可能性。除了聚酮合成酶SgcE，刘文等［5］还提出了一系列途径特异的结构基因分别控制各个结构单元的合成。sgcEsgcE11、sgcI、sgcJ、sgcL和sgcF等16个基因负责烯二炔核心的合成；sgcAsgcA6等7个基因sgcA1sgcA6参与脱氧氨基糖的合成；sgcCsgcC5等6个基因参与β氨基酸的合成sgcDsgcD6等7个基因负责杂萘苯环的合成。通过各自途径生物合成的这三个结构单元分别在糖基转移酶(SgcA6)、缩合酶(SgcC5)和酰基转移酶(SgcD6)的催化作用下，与烯二炔核心结合，构成完整的力达霉素发色团分子。对力达霉素生物合成基因簇中结构基因的研究正在进行中，通过生物信息学的分析、在链霉菌中的基因中断实验以及利用基因工程手段将结构基因的片段克隆至大肠埃希菌表达载体中并对表达产物进行酶学分析可以确定这些结构基因在力达霉素生物合成中的相关功能，并获取更多生物合成途径中有关中间产物和反应步骤的信息。目前已陆续报道了sgcD、sgcA1、sgcC1等结构基因的研究分析结果［6～10］。

2、力达霉素化学合成的研究

在力达霉素的化学结构得到解析后，很多实验室都进行着有关力达霉素化学合成方面的工作，希望通过化学手段可以合成出活性相当乃至更强的化合物。根据逆合成分析，朱锦桃等［11，12］合成了烯二炔发色团中五元环状中间体，并在此基础上合成了发色团中烯二炔单元的开链衍生物，但并未得到闭环的烯二炔结构。Inoue等［13，14］在对发色团的结构进行了充分研究之后对发色团的骨架结构和烯二炔的双环［7.3.0］结构进行了合成。由于辅基蛋白Gly96的H原子参与发色团芳构化后的自身降解，该实验室还利用同位素氘(D)取代辅基蛋白Gly96的H原子，改造后的辅基蛋白类似物由于动力学同位素的效应减小了发色团结构降解的速率，增加其稳定性［15］。Semmelhack等［16］报道了由甘露糖出发经12步反应合成力达霉素发色团氨基糖结构单元的路线，认为合成反应的关键步骤在于C4位的内部N取代从而引入顺式氨基以及C5位上烯醇化物的甲基化。

3、力达霉素的分子作用机制与抗肿瘤活性

3.1分子作用机制力达霉素的发色团与DNA小沟相互作用，造成DNA损伤，且有序列特异性，为富含AT的区域。如CTTTT/AAAAG，ATAAT/ATTAT，CTTTA/TAAAG，CTCTT/AAGAG，特别是在GTTAT/ATAAC处［17］，力达霉素与双螺旋DNA小沟结合后插入DNA中，此时药物并未引起DNA的断裂，发色团(Fig.1中1)经MasamuneBergman重排后芳构化转变成有活性的双游离基中间体(Fig.1中2)，然后夺取DNA脱氧核糖上的氢原子(Fig.1中3)，在有氧条件下使核糖基团氧化，引起DNA单链、双链断裂或形成无碱基位点；在厌氧条件下DNA互补双链的脱氧核糖自由基与药物分子共价作用形成DNA的链内交联［18］。在力达霉素切割DNA的过程中自由基中间体的存在可以通过电子自旋共振(electronspinresonance，ESR)技术获得直接有力的证明［19］。

3.2力达霉素对细胞DNA复制的影响力达霉素不但可以造成DNA断裂，同时还抑制DNA复制。用力达霉素处理SV40、EB病毒感染的细胞，然后通过研究SV40、EB病毒的DNA观察力达霉素对细胞DNA可能造成的影响。实验结果发现力达霉素抑制SV40、EB病毒DNA的复制，低浓度力达霉素抑制DNA复制可能与复制蛋白A(RPA)功能的丧失有关，而在高浓度的力达霉素作用下DNA断裂产生的片段可以诱导DNA依赖的蛋白激酶(DNAPK)活性增高，使其作为反式作用抑制因子影响DNA的复制［20～22］。

3.3力达霉素引发细胞凋亡、细胞周期阻滞和细胞裂亡宋旭等［23］利用nucleicacidarrays的方法将细胞总cDNA进行膜杂交，可同时检测出大量基因表达的变化，发现力达霉素改变了HCT28细胞多种凋亡相关基因的表达水平，抑制RhoC的表达，促进TRAF3、DR4、DR5、MCH4、MCH6、TRIP、Apo23、ABLL和STAT1的表达，提示力达霉素可能是通过调节TNF受体家族有关的凋亡信号过程，诱导肿瘤细胞凋亡。用低浓度的力达霉素处理人肝癌BEL7402细胞，力达霉素促进凋亡相关基因cmyc、cfos的表达并抑制在肝细胞癌变中起重要作用的nras基因的表达，同时细胞骨架也发生了明显的变化，微丝排列更整齐，向正常细胞的微丝形态变化。力达霉素引起肿瘤细胞骨架有关组分的变化可能是其抗肿瘤活性的另一种解释［24］。有研究表明高剂量力达霉素处理人红白血病K562细胞引起S期细胞的比例明显升高，死亡细胞的比例明显增加，提示力达霉素引起DNA的损伤发生在S周期时，细胞周期检验点被激活，进而阻止DNA的复制，同时启动DNA修复机制，或者诱发细胞凋亡［25］。力达霉素对DNA的断裂损伤可以引发细胞周期的阻滞，实验结果显示力达霉素抑制内皮细胞增殖并诱导细胞凋亡，低浓度的力达霉素可使内皮细胞被阻滞在G/M1期；高浓度的力达霉素诱导细胞凋亡的发生。同时力达霉素改变内皮细胞中与增殖和凋亡相关的基因的表达，下调抗细胞凋亡蛋白Bcl2和PCNA的表达水平。细胞内游离钙离子浓度也显著的升高，提示由力达霉素引发的细胞凋亡可能与钙离子内流或影响钙离子依赖的下游信号传导通路有一定关联［26］。何其扬等［27］报道了力达霉素在BEL7402活细胞内直接切割DNA可形成梯度条带，并首次观察到染色质凝集的现象，而在其他烯二炔类抗生素诱导细胞凋亡的研究中均未见报道此现象。现已公认的细胞凋亡后期的共同途径是caspases(半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶)的激活。通过测定caspase的活性及与染色质凝集的关系，认为染色质凝集发生的时间早于caspase达到高峰的时间，而少量caspase的活化不足以解释大量的细胞发生染色质凝集的现象。这一现象提示这种染色质凝集的方式有别于典型的细胞凋亡。力达霉素引起细胞死亡(也被称为裂亡)的特征有别于典型细胞凋亡，而裂亡的引发可能与力达霉素诱导的细胞有丝分裂的异常(如中心体的过度复制、多极性纺锤体的形成、多核的形成等)有关［28］，力达霉素在HCT116细胞中造成染色体异常并破坏端粒区的功能，这是由于力达霉素诱导的大量双链DNA断裂引发细胞采取非同源末端结合(NHEJ)方式的修复途径，导致染色体发生错误连接［29］。

3.4力达霉素对肿瘤细胞的抑制作用及实验治疗观察力达霉素对多种肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，对人肺癌、人鼻咽癌、人胃癌细胞等均有强烈的细胞毒作用。尚伯阳等［30］报道力达霉素对体外培养的肝癌细胞有高度杀伤作用。单核细胞直接细胞毒性测定(MTT)法测定结果表明，力达霉素对人肝癌BEL7402和小鼠肝癌22细胞增生有强烈的抑制作用，抑瘤率呈剂量依赖性。以IC50相比较，力达霉素细胞毒性比丝裂霉素C强10000倍以上。力达霉素对小鼠移植性结肠癌(皮下、盲肠、肝内)生长有明显抑制作用，对肝转移也有显著抑制作用，尤其是对较大转移灶有更强的抑制作用［31］。力达霉素的对肿瘤的抑制还表现在具有抑制肿瘤血管生成和抗侵袭作用。bFGF是重要的肿瘤血管生成因子，肿瘤生成时，储存于细胞基质中的bFGF被大量释放出来，同时肿瘤细胞中bFGF的基因表达及生物合成异常活跃。甄红英等［32］利用鸡胚尿囊膜模型证实力达霉素是很强的血管生成抑制剂。实验还证明力达霉素对bFGF与其受体结合有明显抑制作用，提示力达霉素抑制bFGF与受体结合，阻断bFGF在血管生成过程中诱导内皮细胞的增生和迁移，抑制血管生成、肿瘤生长及抗肿瘤转移。另有研究显示，力达霉素对侵袭调节基因的表达可产生一定影响，促进人结肠癌HCT8细胞TIMP21基因的表达，抑制MMP9基因的表达从而抑制IV型胶原酶的产生，同时又诱导金属蛋白酶抑制因子的产生，表现出抗侵袭活性［33］。力达霉素与其他临床常用抗肿瘤药物的联合应用可以表现出更强的抑癌效果，有实验观察到力达霉素可以增强顺铂诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡，增强顺铂的抗肿瘤作用。顺铂与力达霉素单用均可使抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平降低，而顺铂与力达霉素联合应用后则强烈抑制Bcl2的表达，几乎达到检测不到的水平，提示增效机制可能在于联合应用降低抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平，导致线粒体膜电位降低，破坏线粒体膜的稳定性，线粒体内钙离子外流至细胞质，进一步诱导细胞凋亡［34］。最近有报道quinacrinenetropsin(QN)的杂交分子与力达霉素共同使用可以显著增强力达霉素诱导双链DNA断裂和细胞凋亡的程度，由于QN为DNA结合配体，加入QN后力达霉素可能与之形成异源二聚体后改变了和DNA序列结合的位点特异性，增强了在富含GC的区域，特别是5′AGG3′/3′TCC5′处的切割。因此，对DNA结合配体的研究可能成为增强力达霉素抗肿瘤活性、减小其化疗应用中副作用的一条有效途径［35］。

4、C1027与单克隆抗体高效偶联物的研究

力达霉素对肿瘤细胞的高效杀伤力使其极有可能成为新型高效抗肿瘤药物，但是缺乏肿瘤特异性的缺点限制了力达霉素应用于化疗。一种行之有效的增强特异性杀伤肿瘤细胞的方法就是将力达霉素作为高效“弹头”用于研制小型化导向药物。由于C1027分子构成的特点，可用多种方法将C1027与单抗连接。抗IV型胶原酶单抗3G11与力达霉素的偶联物3G11LDM与肿瘤细胞H22、HT29、C26呈现出良好的免疫结合活性和较高的抑癌活性。3G11LDM偶联物通过抗IV型胶原酶单抗3G11携带力达霉素到达肿瘤部位实现特异性结合，提高了在肿瘤部位释放的力达霉素的浓度，使其发挥更强的抑瘤作用［36］。完整的单抗分子与药物的免疫偶联物存在分子量大、对实体瘤穿透力差、易产生人抗体抗鼠反应(HAMA)等缺点，近年来设计高效化、小型化的单抗免疫偶联物也一直成为研究的热点。例如力达霉素与大鼠抗人肝癌细胞单抗3A5的Fab′片段的偶联物Fab′LDM，偶联物比游离力达霉素对靶细胞BEL7402细胞集落生成的抑制作用显著增强，偶联物与等剂量游离力达霉素比较，对小鼠移植性结肠癌26细胞显示出更强和更长时间的抑瘤作用［37］。以IV型胶原酶为治疗靶点，制备单抗3G11Fab′片段与力达霉素偶联的小型化免疫偶联物对肝癌细胞H22的细胞毒和治疗作用较游离力达霉素均有显著提高［38］。除化学偶联的方法外，利用基因工程技术将抗体Fv片段和C1027的烯二炔发色团制成分子量仅为387ku的融合蛋偶联物已获得成功。这也为利用基因工程进一步进行scFv与烯二炔偶联的研究奠定了基础［39］。

5、力达霉素的组合生物合成

通过化学全合成的方法获得结构复杂的力达霉素及其结构类似物，以促进作用机制和临床应用的研究虽然已经取得了一定进展，但由于化学结构的高度复杂性，化学全合成力达霉素仍然面临诸多困难，利用这一手段促进临床应用的前景也非常有限。作为有机合成的重要补充，近年来发展的组合生物合成技术为复杂天然产物及其类似物的获得提供了一条生物合成的方法。例如通过增加力达霉素的结构基因拷贝数有可能突破生物合成限速酶的催化瓶颈，使力达霉素的产量在原有基础上大大提高。力达霉素生物合成基因簇中结构基因和调节基因的克隆和功能的确定也为合理化修饰力达霉素的生物合成途径和提高产量提供了可能性。力达霉素生物合成途径的分析显示β氨基酸结构单元上的C22OH基团是在羟化酶SgcC催化下形成的，通过基因敲除的方法将SgcC失活，获得了一种失去OH基团的新型力达霉素，该化合物不仅保留了原有的抗肿瘤活性，在没有辅基蛋白保护的条件下，25℃时稳定性比原化合物至少高出5倍以上［5］。